细胞灌注培养用Cellgard细胞截留板—迈博瑞一次性生物反应器耗材新品上线
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随着国内生物制药行业的迅速发展，细胞灌注培养越来越受到人们关注，因为其可以在较小体积的生物反应器中获得高的细胞密度，其中细胞截留装置是灌流培养工艺开发非常关键的一项，迈博瑞基于常年在过滤、分离及纯化行业的积累，提出了利用深层过滤机制来应对灌流生物反应袋过滤部件提出的挑战，并成功开发出Cellgard细胞截留板。
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1.一次性生物反应袋发展进程
2.一次性灌流生物反应袋的基本要求 3.一次性灌流生物反应袋应用及挑战
4.迈博瑞Cellgard细胞截留板
6.迈博瑞Cellgard细胞截留板的优势 |
一、一次性生物反应袋发展进程
1、一次性生物反应袋
1998年，Wave Biotech公司推出了Wave Bioreactor®摇摆式生物反应器系统，该系统采用一次性生物反应袋Cellbag®作为细胞及微生物培养容器。经过市场多年的使用验证，一次性摇摆式生物反应器系统及其所配套的耗材，已经在全球范围内得到广泛的接受与认可。随着生命科学及生物制药行业的快速发展，行业主体对细胞培养的要求越来越高，更高的细胞培养密度、更短的培养周期、更低的培养成本、更高的培养成功率等。因此，一次性生物反应器耗材制备技术、生物培养工艺等学科也在不断发展，更新迭代。
图1：®示意图（图片来自GE）
2、带过滤器的一次性生物反应袋
2001年，Dr. Vijay Singh发明了带过滤器的一次性生物反应袋产品，见图2（专利号US6544788），该产品能够将目标物质，如细胞、微生物等，通过所述的“过滤器”截留在反应袋内部，同时将废培养基液体通过“过滤器”排出反应器外，并且实现新鲜培养基加入，从而实现了在Wave Bioreactor®及一次性反应袋产品中连续化灌注培养细胞及微生物，为微生物培养工艺、生物制药上游细胞扩增工艺提供了有力的工具。
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图2：带过滤器的一次性生物反应袋示意图（图片来源：US6544788）
3、一次性灌流生物反应袋
该技术发展到今天，最为行业所熟知的产品，即为Cytiva公司在售的XuriTM系列一次性灌流生物反应袋产品，见图3。随着专利US6544788的到期，全球一次性耗材生产商也陆陆续续开始了一次性灌流生物反应袋产品的开发和商业化工作。
图3：XuriTM系列一次性灌流生物反应袋产品（图片来自Cytiva）
二、一次性灌流生物反应袋的基本要求
一次性灌流生物反应袋的基本要求，是在产品使用者的生物培养工艺条件下，保证所培养的微生物或细胞，达到预期的增殖密度，且在该过程中，起到截留作用的“过滤器”不堵塞，即液体能够在较低的压力下通过所述过滤装置，同时，“过滤器”能够有效截留被培养物质，即过滤装置下游几乎无微生物或细胞穿透。因此，由上述可见，“过滤器”的截留性能是决定一次性灌流生物反应袋能否满足使用要求的关键核心部件。
三、一次性灌流生物反应袋应用及挑战
1、一次性灌流生物反应袋主要应用
- 一次性灌流生物反应袋的一个重要应用点，位于生物制药工艺环节中的细胞扩增工艺段。
- 在细胞扩增阶段，使用者期望能够通过灌流培养的工艺，实现对于CHO等工程细胞的高密度细胞培养。
高密度CHO细胞灌流培养的益处为：
- 一方面，可以提高细胞扩增效率，甚至有可能减少1-2个细胞扩增工艺步骤，节省时间、原材料、金钱、人力成本，减少染菌风险，提高成功率
- 另一方面，在一些利用工程细胞表达目标蛋白、收获病毒载体、获得mRNA疫苗的小规模研产活动中，高细胞培养密度能够带来更高的目标物滴度，并提高效率
下图4比较了一个用常规方法将细胞扩大到500L生产用生物反应器（n）中的例子，使用高密度细胞库方法减少了中间两个转瓶培养的步骤，可以直接接种到2L的波浪生物反应器中。使用波浪生物反应器（2L和20L）代替转瓶（125ml到10L）大大减少了需要在超净台中操作的次数。这种替换使整个过程在一个封闭系统中进行，提高了操作成功率。
图4：常规与改进的细胞培养工艺过程比较（图片来源：Bioprocess Int）
2、一次性灌流生物反应袋在高细胞密度中面临的挑战
高细胞密度对于灌流生物反应袋的挑战是巨大的，尤其当细胞密度上升后，对于过滤部件的压力尤为明显。
- 高细胞浓度时，过滤部件需要能够维持灌流工艺的进行，此即要求过滤部件面对高浓度料液挑战时不被堵塞；
- 再者，被培养物，如细胞、微生物等由于本身结构柔软，在较低压力驱动下极容易穿透过滤介质。
- 另外一个容易被忽视的地方，在于灌流生物反应袋中的过滤部件在整个培养过程中是随着Wave Bioreactor®不断“随波逐流”的，长时间的培养需求对过滤部件的机械可靠性能提出了更高的要求。
综上，一款合格的适用于Wave Bioreactor®的截留过滤部件需要满足高载量、长寿命、高截留效率、高机械可靠性等要求。迈博瑞基于常年在过滤、分离及纯化行业的积累，提出了利用深层过滤机制来应对灌流生物反应袋过滤部件提出的挑战，并成功开发出Cellgard细胞截留板。
三、迈博瑞Cellgard细胞截留板
迈博瑞开发的Cellgard细胞截留板是利用超高分子量聚乙烯粉末烧结工艺制成的一种深层过滤介质，见图5，有17×17cm和50×30cm两种尺寸，厚度为3mm，见图6。针对生物制药行业对于工程细胞（如CHO DG44细胞，CHO K1细胞，HEK 293细胞等）扩增培养的具体需求，Cellgard板材的孔径被设计为7μm，同时，Cellgard高达300N/mm的穿刺强度，大大提高了截留部件的机械可靠性。这样的设计，能够良好的满足灌流生物反应袋对截留过滤部件提出的挑战。在MS与客户的灌流细胞培养评测实验中，Cellgard细胞截留板均完美的实现了不同条件下的细胞培养并达到测试预期。
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图5：MS Cellgard细胞截留板 |
图6：MS Cellgard细胞截留板尺寸示意图 |
四、Cellgard细胞截留板性能实验分析
实验一：2L细胞培养
图7：灌流式生物反应袋结构示意图
在第一组测试中，尺寸为17×17cm2的Cellgard细胞截留板被制作成2L灌流式生物反应袋（见上示意图7）。该测试主要考察样品灌流袋在未有蛋白表达情况下的细胞扩增情况，所用细胞株为CHO K1。在设置的另外两组平行实验中，同样规格大小的两个2L灌流反应袋分别装载标称孔径1微米的微滤膜及竞品细胞截留板作为灌流过滤部件。该测试约定，当出现细胞泄露、截留板堵塞、细胞活率下降至90%以下等情况时，停止实验。
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在为期8天的培养过程中，装配有Cellgard细胞截留板的反应袋中的细胞浓度顺利增殖到近120 M/ml的浓度，Day 7-8的培养中，跨膜压差略微上升，细胞活率略下降，但是膜后收获液未见细胞泄露，与平行对照组相比，同期细胞活率未见明显区别， |
装载微滤膜的反应袋Day 5出现严重的堵塞现象且下游伴随约30%的细胞泄露，细胞活率较好， |
装载有竞品截留板的反应袋Day 3出现细胞泄露，至Day 5时，泄露率达30%以上，细胞活率维持较好， |
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图8：Cellgard 2L WAVE 培养天数与细胞密度、细胞活率、跨膜压差、细胞泄露趋势图 |
图9：微滤膜 2L WAVE 培养天数与细胞密度、细胞活率、跨膜压差、细胞泄露趋势图 |
图10：竞品截留板 2L WAVE 培养天数与细胞密度、细胞活率、跨膜压差、细胞泄露趋势图 |
实验二：50L细胞培养
第二组测试主要考察被培养的细胞在表达蛋白的情况下，Cellgard截留板作为过滤部件的表现。所用Cellgard截留板尺寸为30×50cm2，反应袋体积为50L。该培养实验的预设目标，是利用灌流式生物反应袋将CHO细胞培养至70 M/ml的细胞浓度，并至少维持5天以上，同时观察蛋白表达及收获液中的蛋白收率情况
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本次培养起始阶段细胞接种密度为0.3 M/ml，3天后细胞顺利进入对数生长期，到Day 10时达到最高细胞密度84.7 M/ml。经灌流速率、供养等参数调控后，培养密度顺利维持在70 M/ml以上并保持较高的细胞活率， |
同时，细胞蛋白表达亦进入对应的高峰期。经测量反应袋内及截留板下游蛋白浓度，可得收获端蛋白收获率。Cellgard细胞截留板上下游几乎无法测出蛋白浓度差，蛋白收获率近100%，见图12。该特性相较利用微滤膜、超滤膜技术实现灌流功能的器件相比，具有独特的优势。 |
灌流培养进行至Day 18时，Cellgard细胞截留板下游开始探测到有活细胞穿透，此时对应的跨膜压差增长到50mbar。随着灌流培养继续进行，跨膜压差继续增长，细胞穿透更加明显，而细胞蛋白表达及下游收获率几乎不受影响，见图13。细胞穿透的原因一般是由于跨膜压差的驱动使得细胞发生了形变而穿越了截留板的微孔结构。我们建议用户在实际培养过程中监控跨膜压差，并根据实际培养情况调整培养工艺。 |
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图11：50L灌流袋细胞培养天数与细胞密度、细胞活率趋势图 |
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图12：50L灌流袋细胞培养天数与mAB浓度、mAB收获率趋势图
图13：50L灌流袋细胞培养天数与跨膜压力、收获液细胞密度趋势图
至此，在两种不同培养工艺条件下，Cellgard截留板均实现了高细胞培养密度、高截留率、长使用寿命的目标，培养情况均符合实验预期。Cellgard产品能够为一次性灌流式生物反应器的高密度细胞培养提供有力支撑。应当注意的是，由于用户不同的培养工艺可能导致不同的培养结果，以上两组实验数据仅供参考，不可视为标准结果。
五、迈博瑞Cellgard细胞截留板的优势
- 利用深层过滤机制，可实现更高密度的细胞培养，且抗堵塞能力强；
- 更高的机械强度，避免使用过程中出现因机械损伤导致的泄露；
- 特殊的孔径设计，避免细胞泄露前提条件下，对蛋白等目标产物几乎无截留。
Cellgard细胞截留板产品现已开放试用，欢迎新老客户咨询，产品尺寸可根据用户需求进行订制，详情请咨询您身边的MS销售工程师。